目的:构建同时干扰人垂体瘤转化基因(PTTG)和生存素(survivin)基因表达的RNA共干扰载体,并检测其对人脑胶质瘤U251细胞中PTTG基因和survivin基因的干扰作用。方法:根据GenBank数据库中PTTG和survivin的cDNA序列设计干扰序列,构建干扰PTTG和生存素基因的重组干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG siRNA和pGenesil-2.1-survivin siRNA。酶切、测序鉴定正确后,将pGenesil-2.1-Survivin和pGenesil-2.1-PTTG质粒分别进行HindⅢ和BamHⅠ双酶切,1%琼脂糖凝胶电泳分别回收质粒survivin双酶切大片段和质粒PTTG双酶切小片段(约380bp),将质粒survivin回收大片段与质粒PTTG回收小片段进行连接,得到双干扰质粒pGenesil-2.1-PTTG-survivin siRNA,酶切鉴定,同时检测其对U251细胞PTTG和survivin基因mRNA表达的干扰作用。结果:测序和酶切鉴定结果显示,pGenesil1-PTTG、pGenesil1-survivin和双干扰质粒pGenesil2.1-PTTG-survivin siRNA构建正确;RT-PCR结果显示,将双干扰质粒转染U251细胞48h后,U251细胞中PTTG基因和survivin基因mRNA表达明显降低。结论:成功构建了能同时干扰PTTG和survivin基因的双干扰pGenesil1-PTTG-Survivin siRNA表达载体,并可有效抑制U251细胞PTTG和srvivin基因mRNA的表达。
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