目的:探讨外周血单个核细胞的分离、冻存及复苏工艺,实现外周血单个核细胞的长久保存。方法:采集50岁以上健康志愿者外周血50-100 ml,应用Ficoll密度梯度离心法分离单个核细胞;采用程控降温法逐级降温,将细胞保存于-196℃液氮中。根据冻存时间进行细胞复苏,分析其冻存前后活性、回收率与表型变化,最后与对照组(直接分离的未经冻存的外周血单个核细胞)一起,经体外激活扩增培养,对比其表型与扩增效率,分析冻存对细胞的影响。结果:Ficoll密度梯度离心后获得的单个核细胞活力为99.6%±0.4%,回收率58.4%±6.52%。冻存24个月后,复苏细胞回收率89.7%±3.82%。细胞经体外激活扩增培养,得到能够杀伤肿瘤细胞的细胞群扩增活化的自体淋巴细胞(AIL)(CD3~+CD8~+细胞毒性T细胞比例≥45%,CD3~+CD56~+NKT细胞比例≥10%,CD4~+CD25~+NKT细胞比例≤10%),其与对照组细胞在扩增能力、细胞纯度、细胞毒活性等方面无显著性差异。结论:体外人工分离的外周血单个核细胞经过长时间冷冻保存后仍可维持其高活性,并可诱导生成具有抗肿瘤活性的细胞群,该结果对单个核细胞保存、扩增活化的自体淋巴细胞的应用具有重要意义。
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