为了探究热休克蛋白70（HSP70）在结直肠癌恶性进展中的功能,试验以小鼠结直肠癌MC38细胞为核心模型,先针对Hsp70（小鼠）与HSP70（人）基因序列设计并合成用于瞬时敲低的小干扰RNA（siRNA,siRNA1,2,3）及用于CRISPR/Cas9稳定敲除的单向导RNA（sgRNA,sgRNA1,2,3）。通过脂质体转染技术进行Hsp70的瞬时敲低与稳定敲除;其中,利用嘌呤霉素对转染sgRNA质粒的细胞进行压力筛选,获得Hsp70稳定敲除的MC38细胞系。试验设对照（Control）组、siRNA阴性对照（si-NC）组、敲低组（siRNA1、siRNA2、siRNA3组）、敲除组（sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3组）,采用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和Western-blot在m RNA和蛋白水平验证了敲低与敲除效率。选取敲低组和敲除组中效果较好的其中一组（分别简称为siRNA组和sgRNA组）运用细胞计数试剂盒-8（CCK-8）法、结晶紫染色试验、克隆形成试验及穿孔（Transwell）试验系统评估Hsp70功能缺失对细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响。为验证核心发现在人源系统中的普适性,采用人源SW1116细胞进行平行验证。结果表明:在MC38细胞中,siRNA1、siRNA2、siRNA3组Hsp70 mRNA与Hsp70蛋白表达水平均极显著降低（P<0.001）,敲除组完全检测不到Hsp70 m RNA与Hsp70蛋白表达。siRNA3对Hsp70蛋白表达抑制最显著,因此后续试验选用siRNA3和sgRNA3进行。培养24,48,72 h,与Control组相比,si-NC组OD450值未发生显著变化（P> 0.05）,siRNA组与si-NC组相比、sgRNA组与Control组相比,OD450值极显著降低（P<0.01、P<0.001）。在结晶紫染色试验中,与si-NC组和Control组相比,siRNA组和sgRNA组OD595值均极显著降低（P<0.001）;在克隆形成试验中,与Control组相比,sgRNA组MC38细胞的克隆数目极显著降低（P<0.01）;在迁移侵袭试验中,与si-NC组和Control组相比,siRNA组和sgRNA组迁移与侵袭的细胞数目显著或极显著降低（P<0.05或P<0.001）。...
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